Agarosgelelektrofores är en av de vanligaste elektroforesteknikerna som är relativt enkel och okomplicerad att utföra men har stor upplösningsförmåga. Agarosgelen består av mikroskopiska porer som fungerar som en molekylsikt som separerar molekyler baserat på laddning, storlek och form.
Agarosgelelektrofores är en kraftfull separationsmetod som ofta används för att analysera DNA-fragment som genereras av restriktionsenzymer, och det är en bekväm analytisk metod för att separera DNA-fragment av varierande storlekar från 100 bp till 25 kb. DNA-fragment mindre än 100 bp separeras mer effektivt med polyakrylamidgelelektrofores medanpulsfältsgelelektroforesanvänds för att separera DNA-fragment större än 25 kb. Agarosgelelektrofores kan också användas för att separera andra laddade biomolekyler som RNA och proteiner.
Innehållsförteckning
Princip
Separationsmediet är en gel gjord av agaros.Agaros är isolerad från tångsläktena Gelidium och Gracilariaoch består av upprepade agarobios (L- och D-galaktos) subenheter. Under gelning associeras agarospolymerer icke-kovalent och bildar ett nätverk av buntar vars porstorlekar bestämmer gelens molekylära siktningsegenskaper. I allmänhet gäller att ju högre koncentration av agaros är, desto mindre är porstorleken.
För att separera DNA med hjälp av agarosgelelektrofores laddas DNA:t i förgjutna brunnar i gelén och en ström appliceras. Fosfatryggraden i DNA (och RNA) molekylen är negativt laddad, därför när den placeras i ett elektriskt fält,DNA-fragment kommer att migrera till den positivt laddade anoden.Eftersom DNA har ett enhetligt förhållande mellan massa och laddning separeras DNA-molekyler efter storlek.
Faktorer som påverkar migrationen av DNA
Agaroskoncentration:
Rörligheten hos DNA-molekyler är omvänt proportionell mot gelkoncentrationen. Högre andel geler är robustare och lättare att hantera men rörligheten för molekyler och färgning kommer att ta längre tid på grund av gelens tätare matris. Den vanligaste agarosgelkoncentrationen för att separera färgämnen eller DNA-fragment är0,8 %. Vissa experiment kräver dock agarosgeler med en högre procentandel, såsom 1 % eller 1,5 %.
Storleken på DNA-molekylen
Siktegenskaperna hos agarosgelen påverkar den hastighet med vilken en molekyl migrerar. Separationen uppstår eftersom mindre molekyler lättare passerar genom geléns porer än större. Om storleken på de två fragmenten är liknande eller identiska, kommer de att migrera tillsammans i gelén.
DNA-konformation
Olika former av DNA rör sig genom gelén med olika hastighet; DNA-molekyler som har en mer kompakt form (t.ex.plasmid-DNA) rör sig snabbare genom gelén jämfört med linjära DNA-fragment av samma storlek. Migrationshastigheten för linjära fragment av DNA är omvänt proportionell mot log 10 av deras storlek i baspar. Detta innebär att ju mindre det linjära fragmentet är, desto snabbare migrerar det genom gelén.
Tillämpad spänning
Rörligheten hos DNA-molekyler påverkas också av den applicerade spänningen. Inom ett intervall, ju högre pålagd spänning, desto snabbare blir provmigreringen.
Procedur
Framställning av agarosgelmatris
Mittpunkten i agarosgelelektrofores är den horisontella gelelektroforesapparaten. Gelen tillverkas genom att lösa agarospulver i en kokande buffertlösning.
Koncentrationen av agaros i en gel beror på storleken på DNA-fragmenten som ska separeras, med de flesta geler mellan 0,5%-2%. Lösningen kyls sedan till ca.55°Coch hälls i en gjutbricka som fungerar som en form. En brunnformad mall (ofta kallad en kam) placeras tvärs över änden av gjutbrickan för att bilda brunnar när gellösningen stelnar.
Efter att gelén stelnat sänks gelén ned i en buffertfylld elektroforeskammare som innehåller en positiv elektrod (anod) i ena änden och en negativ elektrod (katod) i den andra. Buffertens volym bör inte vara större än 1/3 av elektroforeskammaren. De vanligaste geldrivna buffertarna är TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) och TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA).
Provberedning och lastning
Prover förbereds för elektrofores genom att blanda dem med laddningsfärgämnen. Gelladdningsfärgämne tillverkas vanligtvis vid 6X koncentration (0,25 % bromfenolblått, 0,25 % xylencyanol, 30 % glycerol). Ladda färgämnen som används i gelelektrofores tjänar tre huvudsyften:
- lägg till densitet till provet, så att det sjunker ner i gelén.
- ger färg och förenklar lastningsprocessen.
- färgämnena rör sig med standardhastigheter genom gelén, vilket möjliggör en uppskattning av avståndet som DNA-fragment har migrerat.
Dessa prover levereras till provbrunnarna med en ren mikropipett (variabel automatisk mikropipett är att föredra).
Etidiumbromid kan tillsättas till gelén under detta steg eller alternativt kan gelén också färgas efter elektrofores i löpbuffert innehållande 0,5 μg/ml EtBr i 15-30 minuter, följt av avfärgning i löpbuffert under lika lång tid.
Applicera elektrisk ström och separera biomolekyler
En likströmskälla (likström) är ansluten till elektroforesapparaten och en elektrisk ström appliceras. Laddade molekyler i provet kommer in i gelén genom brunnarnas väggar. Molekyler som haren negativ nettoladdningmigrera motpositiv elektrod (anod)medan nettopositivt laddade molekylermigrera motnegativ elektrod (katod).Bufferten fungerar som en ledare av elektricitet och styr pH, vilket är viktigt för laddningen och stabiliteten hos biologiska molekyler. EftersomDNA har en stark negativladdning vid neutralt pH, migrerar den genom gelén motpositiv elektrodunder elektrofores.
Den blålila färgen möjliggör visuell spårning av provmigration under elektrofores. Gelen körs tills färgämnet har migrerat till ett lämpligt avstånd.
Visualisering
Agarosgelen måste efterfärgas efter elektrofores. Den vanligaste färgen för att visualisera DNA är etidiumbromid (EtBr)*. Alternativa färger för DNA i agarosgeler inkluderar SYBR Gold, SYBR green, kristallviolett och metylblått. Känsligheten för metylenblått och kristallviolett är låg jämfört med etidiumbromid. SYBR guld och SYBR grönt är mycket känsliga men dyrare än EtBr.
EtBr fungerar genom att interkalera sig själv i DNA-molekylen på ett koncentrationsberoende sätt. När de utsätts för en kortvågig ultraviolett ljuskälla (transilluminator) aktiveras elektroner i den aromatiska ringen av etidiummolekylen, vilket leder till frigöring av energi (ljus) när elektronerna återgår till grundtillståndet. Detta möjliggör en uppskattning av mängden DNA i ett visst DNA-band baserat på dess intensitet.
*Etidiumbromid är misstänkt mutagen och cancerframkallande, så det måste hanteras med försiktighet. Det är ett farligt avfall så måste kasseras enligt strikta lokala och/eller statliga riktlinjer. Fläckar som innehåller metylenblått anses vara säkrare än etidiumbromid, men bör ändå hanteras och kasseras med försiktighet.
Den exaktastorlekarav separerade DNA-fragment kan bestämmas genom att plotta logaritmen av molekylvikten för de olika banden i en DNA-standard (DNA-stege) mot avståndet som varje band tillryggalagt. DNA-standarden innehåller en blandning av DNA-fragment av förutbestämda storlekar som kan jämföras med de okända DNA-proverna.
DNA-koncentrationer kan uppskattas genom:
A. Tar absorbans vid 260 nm.
Vid 260 nm motsvarar en absorbans (A) på 1 enhet en koncentration av:
- 50 μg/ml för dsDNA
- 40 μg/ml för RNA
- 33 μg/ml för ssDNA
- 20-30 µg/ml för oligonukleotider
Även om denna metod är snabb och oförstörande och ger information om provets renhet (t.ex. närvaro av protein eller organiska föroreningar), erhålls tillförlitliga uppskattningar endast med koncentrationer på minst 1 μg/ml. Dessutom kan denna metod inte skilja mellan DNA och RNA.
B. Intensitet av etidiumbromidfluorescens:
Mängden DNA i ett prov kanuppskattas från intensiteten av etidiumbromidfluorescens(fluorescens som emitteras av etidiumbromid är proportionell mot mängden DNA). DNA-mängden i en "okänd" lösning kan uppskattas genom att jämföra dess nivå av fluorescens med intensiteten av kända mängder DNA av liknande storlek. Denna metod är användbar om ett DNA-prov är kontaminerat med andra föreningar som absorberar i UV-området eller är för utspätt för att mäta vid 260 nm.
Referenser och vidare läsning
- Agarosgelelektrofores för separering av DNA-fragment.Pei Yun Lee, John Costumbrado, Chih-Yuan Hsu, Yong Hoon Kim J Vis Exp. 2012; (62): 3923.
- Principer och praxis för agarosgelelektrofores:EDVOTEK
- Agarosgelelektrofores: Rice University
- Agarosgelelektrofores av DNA – princip, protokoll och användningsområden: Laboratoryinfo.com